谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表白及运用（三）

2.3 重组菌全细胞转化制备GABA的谷氨杆菌工艺优化

2.3.1 温度对于重组菌全细胞转化破费CABA的影响

酶法制备GABA是一个不可逆反映，适宜的酸脱羧酶温度可能使GABA转化率抵达最大，以是枯草经由配置差距的酶转化温度来探究温度对于GABA转化率的影响。以100g/L的芽孢用谷氨酸为底物，溶于去离子水中，表白退出湿菌体(在55℃水浴锅预处置50min，及运改善细胞膜的谷氨杆菌通透性)30U/g，在150r/min的酸脱羧酶水浴摇床中妨碍转化，反映历程中，枯草操作pH为5.0。芽孢用温度梯度配置为2五、表白30、及运3五、谷氨杆菌40、酸脱羧酶4五、枯草50℃，反映24h后妨碍反映并妨碍煮沸处置，12000r/min离心5min患上上清液，适量稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法妨碍检测，服从见图9。转化率随温度飞腾逐渐后退.当转化温度抵达40℃时，GAD-0以及GAD-PL转化率抵达最高，分说为64.78％以及82.27％，不断降高温度，转化率反而飞腾。这是由于枯草芽孢杆菌细胞壁厚，而反映温渡过低时，底物与胞内酶液无奈短缺打仗使患上转化率低：当反映温渡过高时，酶与PLP晃动性差，从而影响GABA的转化率。

2.3.2 DH对于重组菌全细胞转化破费GABA的影响

以100g/L的谷氨酸为底物.溶于去离子水中，退出预处置过的湿菌体30U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床巾妨碍转化，反映历程中，每一隔2h用0.6mol/L的H₂S0₄或者NaOH调节pH，使其不断与初始pH坚持不同。pH梯度配置为3.五、4.0、4.五、5.0、5.五、6.0，反映24h后妨碍反映并妨碍煮沸处置，12000r/min离心5min患上上清液，适量稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法妨碍检测。服从见图10，当pH为4.5或者5.0时，GABA转化率最高，GAD-0的GABA转化率为75.45％以及76.21％，GAD-PL的GABA转化率为84.54％以及84.21％。当DH小于4.5时，底物-水谷氨酸钠在酸性条件下简略酸水解天生谷氨酸析出，从而组成乳红色混浊液体.有利于酶与底物的短缺散漫；当pH大于5.0时有利于酶活性巾心的赖氨酸残基以shifft-碱与PLP、底物散漫，从而抑制GABA的天生。可见，酶转化法制备GABA的pH耐受规模窄，过酸或者过碱都有利于酶匆匆反映妨碍，思考在高品质浓度底物下，过低的pH更易导致底物析出，以是酶转化最适pH为5.0。

2.3.3 加菌量对于重组菌全细胞转化破费GABA的影响

以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，退出预处置过的差距湿菌体(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴摇床中反映24h，反映历程中，操作pH为5.0。反映停止后妨碍煮沸处置，12000r/min离心5min患上上清液，适量稀释后用氨基酸柱前衍生法妨碍HPLC检测。服从见图11，重组菌全细胞转化率随着加菌量的削减而逐渐后退，其中GAD-PL以及GAD-0分说在40U/g以及50U/g时将底物残缺转化，转化率抵达100％。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是由于前者细胞巾的PLP含量高于后者，PLP作为辅助因子有利于酶匆匆反映的妨碍。
 

2.3.4 反映光阴对于重组茵全细胞转化生严GABA的影响

以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，退出预处置过的差距湿菌体，GAD-0以及GAD-PL退出量分说为50U/g以及40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反映24h，反映历程中，操作DH为5.0。反映停止后妨碍煮沸处置，12000r/min离心5min患上上清液，适量稀释后用HPLC-OPA柱前衍生法妨碍检测，服从见图12。在0～20h，GAD-0以及GAD-PL转化分解GABA的产量随时问缩短快捷削减，在20h时转化率抵达100％，之后随着反映妨碍，转化率再也不爆发变更。

2.3.5 底物资量浓度对于重组菌全细胞转化生严GABA的影响

以200g/L的谷氨酸为初始底物，溶于去离子水中，退出预处置过的差距湿菌体，GAD-0以及GAD-PL力口菌量分另0为50U/g以及40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反映6h后，每一隔3h补加1.27g的谷氨酸同体至底物资量浓度分说为200、250、300、350、400g/L，反映历程中，操作pH为5.0，反映48h。反映停止后妨碍煮沸处置，12000r/min离心5min患上上清液，适量稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法妨碍检测。服从见图13，当底物资量浓度抵达400g/L谷氨酸时，GAD-0以及GAD-PL转化破费GABA的转化率分说从100％(底物资量浓度350g/L谷氨酸)着落为97.72％以及98.43％。综合思考，为后退工业破费功能以及节约卑劣分说纯化老本，抉择350g/L作为酶法制备GABA的最适底物资量浓度。

3 结语

作者乐成构建着重组表白了含有Escherichiacoli源头的gadB基因的重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。试验表明在发酵历程中削减0.5妹妹ol/L辅酶前体PL的GAD总酶活抵达28.14U/mL，是比力总酶活的1.72倍。进一步优化重组菌全细胞酶法破费GABA的工艺条件，服从表明，当温度为40℃，pH为5.0，GAD-0以及GAD-PL的最适加菌量分说为50U/g以及40U/g时，GABA转化率抵达100％。当谷氨酸品质浓度为400g/L时，GABA产量分说为275.60扎以及273.61g/L。综上所述，作者审核了菌体发酵哺育历程中削减辅酶前体PL对于重组菌产GAD及制备GABA的影响，开拓了一种不需要在发酵历程以及酶转化系统巾削减高尚辅酶PLP就能高效破费GABA的T艺技术，为GABA在食物以及医药行业中的普遍运用打下了坚贞根基。

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